肥胖患者为什么***食时间要延长？
人们只能在48小时内***饮无卡路里的饮料，间歇性***食包括在进食和***食之间转换，以使身体（尤其是消化系统）得到休息。在这段时间内，人体从储存的燃料源中产生能量。48小时***食是间歇性***食的扩展形式。它涉及整整2天不消耗任何卡路里。尽管***食消除了含有卡路里的食物，但在整个***食过程中还是要喝很多无热量的液体，例如水，以保持身体水分，这仍然很重要。有些人可能会使用48小时***食来减少卡路里摄入并帮助他们减肥。其他人可能会使用快餐来支持消化系统健康。
方法
一个简单的48小时***食将使用人体的睡眠时间安排来缩短时间。例如，星期一开始，在当天晚上停止进食。然后在星期三晚上再次开始进食。使用这种方法，将在睡觉前给自己的身体足够的时间来消化星期一的最后一餐饭。到星期二起床时，他们已经***食了10-12个小时。然后，在星期二和星期三只喝无卡路里的液体，例如水，凉茶和黑咖啡。当星期三晚上到来时，享用简单便餐。从星期四开始，他们可以逐渐恢复常规饮食。水是任何快速运动中最重要的需求。液体可以使身体和细胞保持水分，并帮助消除浪费。重要的是，要确保人们喝大量的水，以免在***食中出现脱水。建议人们在尝试48小时***食之前尝试其他不太极端的间歇性***食。有一个16：8方法，该方法包括在8小时的时间内增加饮食，然后在接下来的16小时内仅消耗无卡路里的饮料。从较短的***食开始，将帮助一个人准备更长的***食，并了解其身体的反应方式。
好处
48小时的***食可以恢复身体，让它从消化中休息一下，专注于其他任务。这种休息可能使它将精力集中在其他地方，例如修复身体。根据2014年一篇文章的作者所说，***食可以减少肥胖，高血压，哮喘和类风湿关节炎。肥胖症的一项研究指出，定期间歇性***食可为身体带来许多好处，包括：改善脑功能降低血压和心率减轻炎症胰岛素敏感性增加增强消化降低葡萄糖水平减少氧化和应力标记研究人员认为，这些好处中的许多是由于减肥的影响。
自噬
自噬的概念在间歇性***食的支持者中也很流行。用最简单的话说，这是人体去除不再起作用的部分细胞的过程。通过回收或处理受损的细胞材料，自噬可使组织再生。在长期***食期间发生的能量存储耗尽会激活某些触发自噬的途径。2018年的一份评论指出，***食和限制卡路里都是触发人体细胞自噬的两种方式。减慢消化过程可使细胞专注于自我再生。
减肥
***食48小时代表饮食中大量卡路里缺乏，这可以帮助某些人长期减肥。但是，一个人不应太频繁地进行48小时***食。行为科学杂志上的一篇评论文章报道，间歇性***食产生的短期减肥效果与超重和肥胖患者传统的持续卡路里限制相似。因此，从饮食中减少多余的卡路里可能与***食减轻体重一样有效。作为定期间歇性***食计划或健康的减肥方案的一部分，***食48小时可能会帮助一个人达到其长期减肥目标，只要他们以安全的方式这样做即可。
风险性
***食时间较长（例如48小时***食）的副作用很常见，这就是为什么要先尝试较小的***食，以便观察身体的反应。如果一个人感到不适，应停止***食。长期***食的常见副作用可能包括：饥饿和饥饿感消化问题疲劳头晕易怒失眠或半夜频繁醒来恶心头疼晕倒此外，缓慢重新进食食物也很重要。***食后吃大量或过多的食物会过度***消化系统，可能会引起自身的副作用，***食对患有潜在疾病的人影响也不同。另外，有些人应该完全避免***食。孕妇或哺乳期妇女以及体重过轻或饮食失调的人不应***食。随食物一起服用某些药物的人也可能需要避免***食，实行前***咨询下医生。
不健康饮食方式会引发哪些危害
1】Cell metab：科学家找到高脂饮食、肥胖与心血管疾病之间的直接关联
DOI： 10.1016/j.cmet.2017.01.008
肥胖和高脂饮食会导致免疫系统发生有害激活，增加心脏疾病风险。伦敦玛丽女王大学的研究人员最近将他们的这一发现发表在国际学术期刊Cell metaboli***上。
之前研究曾发现肥胖会导致血压和胆固醇水平升高，这两个都是心脏疾病的风险因素。现在研究人员认为肥胖还会触发免疫应答增加心脏病发作风险。这些发现或可帮助开发靶向炎症降低心脏病风险的新疗法。
在这项研究中共有1172名正常人、超重和肥胖者的血液样本，研究人员发现肥胖个体血液中T细胞的水平更高。通过对相同人群进行脂肪分布测量他们还发现身体中部脂肪更多的人与大腿和下半身脂肪更多的人相比，身体中部脂肪更多的人体内有更多的T细胞。
T细胞是免疫应答过程中的重要细胞类型能够保护机体对抗感染。但是这些细胞也会引起炎症加重一些心血管疾病的病情。比如，T细胞会促进动脉粥样硬化疾病中脂肪斑块在动脉的聚集，可能导致心脏病发作或中风。
【2】可怕！不健康的饮食方式或可致超过40万人因心血管疾病死亡！
原始出处：Unhealthy diets linked to more than 400，000 cardiovascular deaths
近日，在举办的2017年美国心脏协会流行病学与预防/生活方式和心血管代谢健康分会上，来自华盛顿大学的研究人员通过研究表示，仅2015年，缺乏健康饮食或者摄入大量不健康食物或许和40多万心脏和血管疾病的发生直接相关。
研究者指出，摄入高水平有利于心脏健康的食物，或者少摄入盐和反式脂肪，或许每年会挽救成千上万名美国人的生命。研究人员Ashkan Afshin教授说道，健康食物的摄入水平较低，以及不健康饮食组分摄入水平较高或许是美国人群因心血管疾病死亡的主要因素，这些健康食物包括坚果、蔬菜、全谷类食物和水果，而不健康的膳食组分包括盐分和反式脂肪。
这项研究中，研究人员对全球的疾病负担、机体损伤以及风险因素之间进行了一项最新研究分析，结果表明，在美国近乎一半的心血管疾病死亡都能够通过改善饮食来预防；而这项研究设计的目的就在于阐明饮食影响心脏和血管疾病的机制，研究依赖于1990年至2012年美国国家卫生和营养的调查数据，相关的食物供应数据来自美国粮食农业组织和其它来源等。
【3】Science：不健康饮食有可能危及子孙
原文报道：Your poor diet might hurt your grandchildren’s guts
现在有一个新的理由可以说服你吃蔬菜。人体肠道内上千亿的微生物以蔬菜中的纤维素作为营养来源，并给我们提供能量。如果纤维素的摄入量下降，大量细菌将不能存活。如今，一项研究通过对几代小鼠连续饲喂低纤维的饲料，发现它们肠道内的微生物多样性随着代际的流传越来越少。这对我们人类的饮食习惯也起到了一定的暗示作用，同时，也可能解释了为什么西方发达国家的人群高发免疫性疾病以及肥胖症。
在人类狩猎采集到早期耕种的时代，每日的纤维素摄入量是如今的三到四倍。这差距在美国尤为明显。研究者们指出，发达国家的人体内微生物多样性相比发展中国家的人要少30%，这很有可能是由于纤维素摄入量不足导致的。
这项新的研究在小鼠水平证实了这说法。Sonnenburg教授与同事们将小鼠在无菌环境中培养，之后给他们喂人类的粪便，使之肠道内定殖人类的肠道微生物。当饲喂低纤维素饲料时，动物们肠道内的微生物多样性发生了明显的下降（60%）。之后，这部分小鼠进行交配，繁殖后代小鼠。结果显示，它们的后代小鼠肠道内竟然没有微生物！作者解释说这是因为亲本肠道内的微生物数量已经低到一定程度，因而无法通过分娩，哺乳等方式传给子代。
【4】孕期饮食不健康容易导致儿童多动症
新闻阅读：Unhealthy diet during pregnancy could be linked to ADHD
一项新研究发现，孕期的高脂肪、高糖饮食可能与儿童多动症相关。
在英国，儿童早发的行为问题(如说谎、好斗)和注意力不集中或多动障碍(ADHD)是儿童心理健康的主要原因。这两种障碍往往会一前一后发生(超过40%的有行为障碍儿童也同时伴有注意缺陷多动障碍)，这与产前母亲痛苦或营养不良等经历相关。
这个新研究的参与者来自“90年代的孩子们”，研究显示，与81名有较少行为问题的儿童相比，83名儿童有早发性的行为问题。研究人员评估母亲的营养如何影响IGF2的表观遗传变化(或DNA甲基化)，该基因（IGF2）参与涉及注意力不集中的胎儿发育和大脑发育区域 -小脑和海马。值得注意的是，在荷兰二战期间，IGF2的DNA甲基化被发现在孕妇体内，这些母亲在此期间忍受着饥饿之灾。
【5】Cell Rep：这么可怕！高糖饮食或让人寿命变短？
doi：10.1016/j.celrep.2016.12.029
近日，来自伦敦大学学院等机构的研究人员通过研究发现，有高糖饮食史的果蝇或许寿命较短，甚至改善果蝇饮食后结果依旧不变，这或许是因为不健康的饮食能够驱动果蝇基因表达的长期重编程效应，相关研究刊登于国际杂志Cell Reports上。
文章中，研究者发现，在果蝇早期生活中给予其高糖饮食能够抑制一种名为FOXO基因的活性，从而诱发长期的效应，FOXO基因对于多种类型有机体的长寿非常重要，包括酵母、果蝇、线虫以及人类等，因此研究者认为这项研究发现具有广泛的意义。
研究者Adam Dobson博士表示，饮食史对于机体健康具有长期的效应，如今我们阐明了其中的一种机制，我们认为，高糖饮食引发的果蝇机体基因重编程或许在其它动物机体中也发生，但我们并不清楚这种现象是否在人类机体中也存在，但种种迹象表明，这种现象在人类机体中也会发生。
【6】Genome Med：怀孕期间母亲高脂肪饮食或可影响婴儿肠道的微生物组
doi：10.1186/s13073-016-0330-z
母亲在怀孕期间的饮食会影响“寄居”在婴儿肠道中的微生物群落—微生物组；近日来自贝勒医学院的研究人员通过研究发现，怀孕期间进行高脂肪饮食的孕妇所生的孩子机体中肠道微生物组和非高脂肪饮食孕妇所生孩子机体肠道的微生物组有着明显的不同，相关研究刊登于国际杂志Genome Medicine上，这项研究非常重要，因为肠道微生物组能够影响婴儿免疫系统的发育以及其从食物中获取能量的能力。
研究者Kjersti Aagaard教授说道，此前研究中我们发现，怀孕期间进行高脂肪饮食的非人类灵长类动物分泌的乳汁会影响后代肠道微生物组长达一年时间，而我们想通过对人类进行研究来找到答案；随后研究者对来自美国一个具有代表性的孕妇群体进行研究，他们让157位母亲回答了调查问卷中的一系列问题，此前研究者证实，快速的饮食调查问卷可以帮助有效鉴别女性在怀孕期间所摄入的饮食类型。
【7】高脂饮食致大脑“挨饿”
德国马克斯－普朗克新陈代谢研究所28日发布公报说，最新研究发现高脂饮食会对实验鼠大脑产生影响，让大脑因无法获得充足的葡萄糖而“挨饿”，长期持续可能会导致糖尿病。
研究人员发现，被喂食高脂肪食物后，实验鼠血脑屏障处的葡萄糖转运蛋白GLUT1很快减少，大脑出现了缺糖的情况，特别是在控制新陈代谢的下丘脑和负责学习和记忆的大脑皮层处。
缺少能量的大脑会对此做出反应：血管内皮生长因子VEGF开始促进GLUT1形成，并将GLUT1直接释放在血脑屏障处，使其更好地为大脑运送葡萄糖。
【8】高盐或高糖饮食会让你快速患高血压
新闻阅读：The downside of your sweet and salty addiction could be rapid-onset high blood pressure
食用果糖是一种水果衍生的糖类，它在许多含糖饮料和加工食品中都存在。在美国和世界各地食用果糖与许多流行病如糖尿病、肥胖、代谢综合征和高血压都有关。近期一项新研究发现果糖大量存在于美国饮食中，可促使个体快速患上盐敏感性高血压。
“大多数美国成年人会从添加的糖中消耗10%或更多的总热量。”Kevin Gordish博士说。因为在美国的饮食中饮料是最常见的添加糖来源，研究人员进行了一项实验，该实验将大鼠分为两组，***组大鼠喂养含有20%果糖的饮用水用来模拟人类软饮料过度消费。第二组大鼠除食物外用白开水喂养两周。在第二周期间，***组大鼠在它们的饮食中还额外添加了盐。
“***组大鼠在第二周期间引入果糖和高盐的特定组合从而引起血压迅速增加，导致高血压发生。果糖相关的高血压与增加的钠潴留，减少的钠排泄，以及帮助清除体内多余盐分的因素减少有关。我们观察到果糖相关的高血压仅仅由有果糖和高盐的饮食引起的，这种饮食并不是一个正常的盐饮食。”Gordish说。“在美国饮食中大量摄入的果糖可导致正常大鼠迅速出现盐敏感性高血压。果糖相关高血压明确是由于果糖(而不是葡萄糖)引起的。此外，果糖对肾有不同程度的有害影响，而相同数量的葡萄糖不见得如此。”
【9】Nature：揭秘高脂饮食如何影响个体结肠癌的发生
doi：10.1038/nature17173
近日，刊登于国际著名杂志Nature上的一项研究报告中，来自美国达纳-法伯癌症研究所(Dana-Farber Cancer Institute)的研究人员通过研究揭示了高脂肪饮食如何促使肠道内皮细胞更加易于癌变，研究者发现，肥胖、高脂肪及高卡路里饮食是引发许多类型癌症的明显风险因子。
文章中，研究者Semir Beyaz指出，对小鼠进行研究我们发现，高脂肪饮食可以驱动肠道干细胞数量激增，同时也会产生一系列其它同干细胞行为非常类似的细胞，也就是说这些细胞可以进行无限期地繁殖并且分化成为其它类型的细胞，这些干细胞及干细胞样细胞更加易于引发肠道肿瘤。此前研究发现，肥胖个体更易于患结直肠癌，而且肠道干细胞更易于积累突变引发结肠癌，这些干细胞位于肠道内侧，名为上皮细胞，其可以产生多种类型的细胞从而形成上皮结构。
文章中研究者对健康小鼠喂食以60%脂肪含量的饮食长达9-12个月，同时调查了小鼠机体中肠道干细胞和肥胖相关癌症之间的关联，典型的美式饮食中通常包含有20%-40%的脂肪，而高脂肪饮食的小鼠体重指数可以增加30%-50%，同时相比正常饮食的小鼠而言，这类小鼠更易于发生肠道肿瘤。高脂肪饮食的小鼠通常在肠道干细胞上会表现出明显的改变，相比正常饮食的小鼠而言，其不仅拥有较多的肠道干细胞，而且这些干细胞可以自行运转。
【10】Cancer Res：西方糖类饮食或增加乳腺癌发生及转移的风险
新闻阅读：Sugar in western diets increases risk for breast cancer tumors and metastasis
近日，发表在国际杂志Cancer Research上的一项研究报告中，来自德克萨斯大学MD安德森癌症中心的研究人员通过研究发现，典型的西方饮食中大量糖的摄入或可增加个体换乳腺癌及癌症向肺部转移的风险，文章中研究者阐明了膳食糖类对名为12-LOX（12-脂氧合酶）的酶类信号通路的效应。
研究者Peiying Yang表示，我们发现，相比进行无糖淀粉饮食的小鼠而言，机体中蔗糖摄入量和西方饮食水平相当的小鼠或许会增加机体肿瘤生长和转移的风险，而这种效应部分取决于12-LOX及相关脂肪酸12-HETE水平的增加。此前流行病学研究结果显示，膳食糖类摄入或对乳腺癌的发生产生重要影响，而炎症被认为扮演着重要的角色。
研究者Lorenzo Cohen博士表示，当前研究调查了在多种小鼠模型中，膳食糖类摄入对机体乳腺肿瘤发生的影响，同时我们还阐明了其中所涉及的机制，尤其是果糖、蔗糖和含高水平果糖的玉米糖浆都会促进乳腺癌中12HETE的产生及癌症向肺部的转移。同时他们还指出，膳食糖类可以诱导12-LOX信号从而增加乳腺癌发生及转移的风险。
10X单细胞空间联合分析揭示了受不同基质细胞群调节的follicle发育
follicle发育是一个复杂的动态过程。follicle被包裹在基质中，一旦follicle发育，follicle就会在不断生长的过程中从皮层移动到髓质，最后到达皮层排卵 。许多这些过程不能仅用毛囊来解释。 通过对小鼠出生后follicle发育关键时间点的单细胞和空间转录组测序，发现ovarian基质细胞不仅是构成 ovarian的主要细胞群之一，其细胞群和空间位置也与follicle发育密切相关 。通过对 细胞通讯的分析发现， ovarian基质细胞是细胞间通讯的主要传递者，它们发出的许多信号被颗粒细胞和卵母细胞接收，参与follicle发育 。 ovarian基质细胞不是同质细胞群。 将单细胞类型与其空间位置信息相结合，将 ovarian基质细胞分为四种类型，即结构性基质细胞、滤泡周基质细胞、基质祖细胞和类固醇基质细胞，每种类型在follicle发育中发挥不同的功能 。对不同空间位置和不同类型基质细胞的深入研究将扩大对follicle发育动态的理解，为 ovarian相关疾病的**带来新的靶点和新方法。
ovarian由两部分组成： 实质和间质 。 follicle是 ovarian的功能单位，包括 ovarian实质，决定了女性的生殖寿命 。它由卵母细胞和嵌入 ovarian基质中的体细胞层（颗粒细胞和膜细胞）组成。 ovarian的大部分，包括皮质和髓质，由具有不同特征的基质组成。大多数follicle嵌入 ovarian皮质的基质中，并在 ovarian髓质的基质中成熟。历史上， ovarian生物学的研究主要集中在受卵母细胞和颗粒细胞（GCs）控制的follicle发生上，而follicle发生中存在许多未解决的问题，仅靠这两种细胞类型无法解释。除了构成follicle的细胞外，嵌入follicle的 ovarian基质对follicle发生有很大贡献，但没有得到足够的重视，因为它是理解follicle发生复杂过程的关键。
ovarian基质由一般成分组成，例如免疫细胞、血管、神经、细胞外基质和未完全表征的基质细胞的混合群体 。大部分 ovarian基质包含未完全表征的基质细胞，包括成纤维细胞样、梭形细胞形和间质细胞。 ovarian基质细胞在follicle发生中具有重要作用，特别是在原始follicle的激活和膜细胞的分化中 。次级follicle可以使用体外培养系统单独生长，而原始和初级follicle必须在含有基质成分的器官培养物中激活。此外，所有在体外培养后成功生产人中期 II (MII) 卵子的研究都使用机械方法而不是酶消化来从 ovarian组织中分离follicle，因为酶消化会对follicle造成损害，同时还能保持残留基质细胞的紧密结合，这些细胞与follicle进行密集的细胞间通讯，并可能具有分化成其他关键细胞类型的能力，例如膜细胞。此外，基质细胞共培养可以改善早期follicle的生长和存活，这对于将体外培养系统成功转化为灵长类动物和人类follicle至关重要。 ovarian基质细胞不仅为follicle发育提供结构支持，而且与follicle具有复杂的双向旁分泌信号。几种生长因子是follicle发生的关键调节分子，包括成纤维细胞生长因子、转化生长因子 β、血小板衍生生长因子、肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子。然而， follicle和基质细胞之间的特定细胞 - 细胞分泌信号仍不清楚 。
尽管有这些新见解，但对 ovarian基质细胞的理解仍然有限，许多问题仍未得到解答。 ovarian基质细胞的不完整表征和分类导致研究中的混淆，这些研究报告了有关基质细胞的发现而没有进一步鉴定。 ovarian基质细胞不是指单个同质细胞群。最近的单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 研究证实了多个基质细胞clusters的存在，但缺乏对整个 ovarian基质细胞类型的全面和完整的表征。基质细胞的分布和亚型可能会因其在 ovarian中的位置而异（例如，皮质与髓质）。 随着follicle的生长和排卵以及黄体的发育，基质细胞的分布也可能发生变化，伴随着周期性的结构变化。整个生殖寿命的变化也很明显，包括纤维化胶原蛋白的增加，如老年小鼠、女性和灵长类动物的 ovarian所示。对于这些不完全表征的基质细胞类型，仔细的本体论、进一步的标记识别以及对区域细微差别的关注是关键的下一步 。
在这项研究中， 生成了小鼠出生后 ovarian follicle发育的单细胞图谱和时空基因表达动态，阐明了 ovarian基质细胞在follicle发育中的重要作用。 细胞间通讯分析描绘了follicle发育不同阶段的细胞类型组之间复杂的细胞间通讯关系，并揭示 ovarian基质细胞是 ovarian中调节follicle发育的主要外向信号细胞类型 。 将 ovarian基质细胞完全表征为四个亚群，即结构基质细胞、滤泡周基质细胞、基质祖细胞和类固醇基质细胞，并进一步进行标记鉴定。 这些基质细胞亚群中的每一个在follicle发育中发挥不同的作用。
为了生成小鼠 ovarian的细胞图，说明follicle发育过程中的时间和空间变化， 通过单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 和空间转录组学方法（10× Genomics Visium 载玻片和高分辨率显微镜） 。 五个时间点的 ovarian被整合到scRNA-seq 分析中：出生后第 3 天、第 5 天、第 7 天、3 周和 8 周。 三个时间点的 ovarian被整合到 10× Visium 分析中：出生后第 7 天、第 3 周和第 8 周。 后一种方法允许探索follicle发育中的细胞特征，以获得详细的细胞群和时间变化 。
能够生成 58,319 个细胞的 ovarian图谱，并根据其标记的表达识别出 21 个被分配细胞身份的clusters。 为了进一步识别clusters，根据已知的细胞类型标记基因分配clusters。 细胞特异性标记基因是卵母细胞（Sycp3）、颗粒细胞（Amhr2）、基质细胞（Col1a1）、内皮细胞（Cdh5）、上皮细胞（Krt19）、免疫细胞（Ptprc）、平滑肌细胞（Des）和 类固醇生成细胞 (Ptgfr)。 这些clusters可分为九个主要细胞类别：（i）基质细胞，（ii）颗粒细胞，（iii）卵母细胞，（iv）内皮细胞，（v）上皮细胞，（vi）免疫细胞，（vii）平滑细胞 肌肉细胞，（viii）类固醇生成细胞，和（ix）未定义的体细胞。 为了进一步获得基因特征的动态模式，鉴定了九个主要的细胞类别clusters特异性标记基因。 在这些细胞类型中，基质细胞和GCs占了绝大多数。
为了系统地绘制由 scRNA-seq 识别的细胞类型在 ovarian内的位置，使用了 10× Visium Spatial Transcriptomics 技术 。在第 7 天、第 3 周和第 8 周检查了三个 ovarian样本，它们代表了三个重要的 ovarian发育阶段。总体而言，使用统一流形近似（UMAP）和投影对九个转录不同的clusters进行分类和可视化。可以清楚地看到九个clusters的位置，伴随着follicle和黄体。然后， 将时空数据与 scRNA-seq 数据相结合，使用 SPOTlight 推断复杂 ovarian组织内细胞类型和状态的位置（关于SPOTlight，大家可以参考文章 10X空间转录组数据分析梳理 、 10X单细胞空间联合分析方法汇总及算法总结 、 10X单细胞空间分析回顾之SPOTlight ） 。如下所示， 将八个明确识别的细胞类别映射到 10×Visium 时空 ovarian组织中，发现基质细胞、内皮细胞和 GC 是卵母细胞周围的三个细胞类别 。可以看到 ovarian细胞类型的所有空间位置。
颗粒细胞（GCs）是follicle中不可或缺的一部分，直接与卵母细胞相互作用 。为了通过UMAP分析在调查期间剖析GC在发育过程中的异质性，将GC群体确定为11个clusters。为了获得基因特征的动态模式，鉴定了GC clusters特异性标记基因。 根据这些分析，绘制了一个遗传动态模型，包括在follicle发育过程中的低分化、mural、卵丘、类固醇生成和增殖性 GC 。已知在早期发育阶段 GC 中表达的基因是 Wt1 和 Foxl2；对于mural GC，Cyp19a1；对于卵丘细胞，Slc38a3 和 Amh；对于类固醇生成的 GC，Cyp11a1 和 Lhcgr。标记基因 Wt1、Slc38a3、Cyp19a1 和 Cyp11a1 在 10× Visium 切片中可视化，与真实的组织学位置相匹配。 低分化GCs的比例随着时间的推移而降低，而卵丘GCs、mural GCs和类固醇GCs的比例随着时间的推移而增加，并在3周或8周达到峰值 。结果与 ovarian和follicle发育过程中的 GC 动力学相匹配。然而，没有发现任何明显的边界来将原始follicle到窦follicle的 GC 分组。
为了剖析整个调查期间 GC 的命运决定，根据上面报道的基因表达，它们沿着伪时间轨迹排列 。获得了三个状态（在伪时间分析中使用的术语，其中“state”被分配来标记 Monocle 中轨迹树的片段）。此外，代表基因（上面确定的 3 个follicle形成阶段的标记基因）的表达以及伪时间轨迹与我们的推断一致。根状态包含大部分差异较小的 GC；状态 1 包含大部分积云 GC、mural GC 和增殖 GC；状态 3 包含大多数类固醇生成 GC。在这样的伪时间轨迹中，3 个分支暗示了具有细胞标记的 GC 的 3 个分化阶段，例如 Wnt6、Wt1、Hmgb2 和 Cyp11a1。对这三个州的代表性基因的 GO 分析显示了相关的途径。此外，分析了两种主要细胞群（基质细胞和 GC）与其他细胞类型之间的细胞串扰。如下图所示， 除了 GC 和其他细胞类型之间广泛的细胞间通讯外，基质细胞和其他 ovarian细胞类型之间的细胞间通讯也更强 。
为了分析这些细胞类型在小鼠 ovarian中的通讯，进一步进行了 CellChat 分析（关于CellChat，大家可以参考文章 10X单细胞（10X空间转录组）通讯分析之CellChat 、 10X单细胞（10X空间转录组）通讯分析CellChat之多样本通讯差异分析 ），以确定follicle发育过程中这些细胞类型之间的细胞通讯 。第 3 天、第 5 天、第 7 天、第 3 周和第 8 周的推断交互次数分别为 723、455、522、329 和 602，第 3 天的交互强度，第 5 天、第 7 天、第 3 周和第 8 周分别为 22.525、6.705、10.16、3.534 和 4.065。 发现第 3 天、第 7 天和第 8 周是细胞通讯的最强时间点 。因此，更多地关注第 3 天、第 7 天和第 8 周。 ovarian中的九种细胞类型之间存在非常复杂的细胞通讯，而基质细胞是信号最强的细胞类型 。进一步的信号传导作用分析表明，在六个重要的 ovarian发育时期， 基质细胞在细胞间通讯中表现出最强的外向相互作用 。 GCs 是在第 3、5 和 7 天接收最多传入受体信号的细胞类型，而上皮细胞是在 3 周和 8 周接收最多传入受体信号的类型。此外，在选定的时间过程中探索了特定类型的细胞通信。 发现基质细胞经常与所有其他细胞交流 。特别是，PTN、MK、ncWNT、PROS、GAS、ANGPTL 和 TWEAK 信号通路积极参与基质细胞的输出信号模式。在传出信号中，MK 在整个follicle发育阶段表达。 PTN 仅在第 3 天、第 5 天和第 7 天检测到，此时原始follicle激活和follicle发育为初级和次级follicle。比较了第 3 天和第 5 天，当原始follicle被激活时，发现 ncWnt、PROS、APELIN、GRN、CALCR、ACTIVIN、IFN-1 和 LIFR 在第 2 天特异性表达，而 IL -1 和 ANNEXIN 在第 5 天特异性表达。其他信号通路，如 TWEAK、PTN 和 MK，在第 5 天的表达水平高于第 5 天。当比较第 7 天和第 5 天的相对信息流时，发现IL-1、ANNEXIN、CCL、BMP、FGF 和 ENHO 在第 5 天特异性表达，而 TWEAK、APELIN、ANGPT、CALCR、CXCL、AMH、PERIOSTIN、PROS、EDN 和 MIF 在第 7 天特异性表达。其他信号通路，如 PTN 和 MK，在第 7 天的表达水平高于第 5 天。还将第 7 天的信号传导与第 3 周的信号传导进行比较，发现 PTN、TWEAK、EDN、MIF、TNF、WNT 、PERIOSTEIN、CXCL、CALCR、APELIN、IL-2和CSF在第7天特异性表达，而NPR2和HH在第3周特异性表达。 这些细胞信号通路在特定follicle发育阶段发生变化，表明分泌信号可能有助于follicle发育阶段 。由基质细胞分泌的 MK 等分泌因子随着follicle激活持续存在，直至follicle完全生长，这可能代表了基质细胞发送的支持follicle发育的重要信息。分析绘制了follicle发育中的关键信号通路。因此， follicle发育过程中这些细胞群之间的细胞通讯提供了更多关于follicle发育调控网络的信息 。
此外，分析了 ovarian基质细胞的 genetic dynamics 。当基质细胞的转录组与发育阶段一起绘制时，鉴定出 11 个细胞clusters。如前所述，鉴定了每个clusters内的新标记基因，其表达根据发育阶段而变化。 CytoTRACE 分析表明clusters 6、7 和 8 可能是基质细胞的root（关于CytoTrace，大家可以参考文章 10X单细胞轨迹分析（拟时分析）之cytotrace ） 。对已识别clusters的特殊细胞标志物的特征图分析表明，Tcf21 在整个 ovarian基质中的表达***，Lum 表达主要在cluster 0、1、2、4、5 和 10 中。 Star 和 Cyp17a1 主要在cluster 1 和 9 中表达，Enpep 主要在cluster 3、7 和 8 中表达，干细胞标记物 Aldh1a2 主要在cluster 6 中表达。基因 Lum、Cyp17a1、Enpep和 Aldh1a2 在 10× Visium 切片中可视化，并使用原位杂交 (ISH)、免疫组织化学 (IHC) 或免疫荧光 (IF) 进行验证。 follicle周围基质细胞中的 Lum 表达支持follicle的生长 。 Cyp17a1不仅位于follicle周围的膜细胞中，而且还位于膜外的一些基质细胞中。此外，Enpep 表达与follicle发育有关，并通过 ISH 得到证实。 Aldh1a2主要在 ovarian上皮和 ovarian皮质基质中表达。结果表明， ovarian基质细胞不是指单一的同质细胞群，可以借助 scRNA-seq 和空间转录组学方法进行明确分类 。
为了剖析整个研究期间基质细胞的命运决定，根据基因表达沿伪时间轨迹对它们进行排序 。可以看到第3天、第5天和第7天的大部分细胞处于root状态，而基质细胞在第7天开始分化。这一发现表明第7天是基质细胞分化的时间点。细胞伪时间轨迹显示 5 个基质细胞状态和 2 个分支点。clusters 6 和 10 处于根状态的起点。结合 CytoTRACE 的结果和特定的细胞标志物进行综合分析，发现cluster 6 可能是基质细胞的祖细胞。该cluster的特征在于与生物过程相关的基因的表达，例如“PI3K-Akt 信号通路”、“粘着斑”和“内质网中的蛋白质加工”，这些基因在状态 1 细胞，表明基质细胞具有幼稚的典型功能。编码“脂质和动脉粥样硬化”、“MAPK 信号通路”和“FoxO 信号通路”成员的基因属于状态 3，证实了基质细胞中存在类固醇激素产生。状态 5 由编码参与“亨廷顿病”、“肌萎缩侧索硬化”和“氧化磷酸化”的蛋白质的基因组成，这表明这些基质细胞处于高功能状态。基因Ptn和Gstm6主要表达在状态1，Enpep主要表达在状态5，Star主要表达在状态 3。此外， 鉴定出4个具有不同模式的基因组，4个基因组的特异代表基因，即 Sfrp1、Fhl2、Tmem100 和 Cebpb 。
为了进一步验证 ovarian基质细胞分类，在 E11.5 和 8 周之间的 11 个时间点对follicle和小鼠 ovarian周围的人 ovarian组织进行了分析 。分析中包括具有直径为 2 mm 和 5 mm 的follicle的人类 ovarian组织。根据已知的细胞标志物， ovarian细胞可分为5个细胞亚群，基质细胞可分为6个clusters。ENPEP+ 滤泡周围基质细胞和 CYP17A1+ 类固醇生成基质细胞包围了人类follicle。然后， 在 E11.5 和 1 天之间的六个时间点将数据与 ovarian整合，并确定了 11 种 ovarian细胞类型。在这些细胞类型中，基质细胞和 GC 也占人口的绝大多数。基质细胞分为 10 个cluster，大多数 Aldh1a2+ 基质祖细胞在 E11.5 和伪时间轨迹的根部出现 。
为了更深入地了解上述四组细胞的功能， 使用 SCENIC 进一步研究了基质细胞特异性 TF 的调节子（转录因子（TF））活性 。在follicle发育过程中确定了几个重要的 TF。基于具有默认过滤参数的 5,481 个过滤基因的 51 个调节子活性，调节子活性与发育阶段相匹配，并列出了具有代表性的调节子。如图所示，一系列 TF 显示出更加动态的模式。例如，Maf、Wt1、Gata6 和 Erg1 主要在早期发育阶段活跃。随着follicle发育的继续，Foxo1、Runx1、Stat1 和 Smarca4 似乎主要在follicle成熟的 3 周和 8 周阶段被激活。由于基质细胞在第 7 天开始在细胞伪时间轨迹中分化成不同的命运，专注于这个时间点。 Yy1、Jdp2、Cebpb 和 Maff 主要在第 7 天活跃。Bclaf1 的调节子活性在第 7 天特别关闭。 这些调节子活性模式可能为 ovarian基质细胞命运的确定提供新的见解 。
此外，当将调节子活性与 ovarian基质细胞亚群联系起来时，发现一些 TF 显著代表特定的 ovarian基质细胞亚群 。 Gata6 和 Wt1 主要在没有滤泡周围基质细胞的基质细胞亚群中活跃。 E2f1 和 Ezh2 主要在滤泡周基质细胞中活跃。 Maff 和 Irf1 等 TF 主要在类固醇基质细胞中活跃。 Irx3、Runx1 和 Smad3 主要在基质祖细胞亚群中活跃。
由于 MK 信号在整个follicle发育阶段表达，将 midkine 添加到与包裹在藻酸盐中的follicle共培养中，以进一步证实外向 ovarian基质细胞信号在follicle发育中的作用。 ovarian基质细胞是外向 MK 信号的主要来源，并且GC是主要目标。受体-配体分析表明，Ncl、Sdc4、(Itga6+ Itgb1) 和 Lrp1 是 MK 信号传导的主要贡献者。从第 3 天、第 5 天、第 7 天、第 3 周和第 8 周对小鼠 ovarian进行了 Mdk ISH 分析。Mdk 主要位于 ovarian基质中，在第 5 天小鼠 ovarian中表达***。随着follicle的发育，Mdk表达主要发生在生长follicle周围的基质中，而在窦状follicle或黄体周围减少，表明它可能在follicle发育和成熟中起重要作用。然后研究了 Mdk 配体的表达和定位。 ISH和IHC均显示Ncl和Lrp1主要在生长follicle的GCs中表达。接下来，将纯化的 MK 添加到培养基中，以在体外与早期次级follicle共培养。结果表明，midkine 显著促进了follicle生长的增加。这些结果证实了 ovarian基质细胞与follicle的串扰作用促进了follicle的发育。
为了研究基质细胞亚群在follicle发育中的作用，使用 ENPEP-PE 抗体通过流式细胞仪分选获得了follicle周围基质细胞。 ENPEP+ 滤泡周围基质细胞比 ENPEP- 细胞更像成纤维细胞。免疫荧光分析显示 ENPEP+ 滤泡周围基质细胞表达 ENPEP 和 COL1A1 但不表达 FOXL2。 ENPEP-细胞不表达 ENPEP 或 COL1A1 并且具有高水平的 FOXL2 表达。 qPCR 分析显示 ENPEP+ 滤泡周围基质细胞具有较高水平的 Pdgfa、Enpep 和 Mdk，而较低水平的 Amhr2 和 Foxl2。在细胞培养过程中，ENPEP+ 滤泡周围基质细胞在传代到第三代 (P3) 时不能增殖，这表明 ENPEP+ 滤泡周围基质细胞可以在体外分化。膜细胞标志物 Star 和 Cyp17a1 的免疫荧光和 qPCR 分析证实，ENPEP+ 滤泡周围基质细胞在长期体外培养中分化为膜样细胞。结果揭示了 ovarian基质细胞类型分类的重要性。这些结果表明， 滤泡周基质细胞不仅具有旁分泌作用，而且还具有分化功能 。
生活很好，有你更好
人有长寿基因吗？
首先，一个人的长寿与否，是由内和外两方面综合决定的，内在的就是受遗传和表观遗传调控的衰老机制，外在的则是环境中的潜在因素。在这里我们只谈基因学的原因。要去找出这样一部分的基因，会有两种方法，***，最便捷也是最直接的方法，就是用从大样本量的全基因组测序结果去分析。通过比较长寿和非长寿人群的基因组景观图(Genomic Landscape)，找出其中有显著差异的基因；第二，是从衰老机制和信号通路去做理论推测，找出执行某些功能的基因。就***种方法而言，获取大样本量的测序数据是一大障碍。在2015年的Nature Communication，发表了一项由多方合作的衰老基因学研究。他们做了一个大规模的meta分析，对14983个人的全血的基因组测序结果进行了基因区别表达的分析，找出了600个与衰老正相关，以及897个与衰老负相关的基因。这1497个基因中，很大一部分的基因功能以及被人类所熟知（例如MYC， LEF1等），但是也有相当一部分衰老相关基因的发现也是全新的（例如CCDC34，DOCK10等），由于这是一项由大规模人体样本测序的研究，它相当有说服力。为了找出这些基因所调控的生物学功能网络，他们由对这个基因列表进行了通路分析(Pathw*** Analysis). 结果见下图。在和衰老负相关的897个基因中，它们主要可以划分为5个功能集合：核酸代谢，核糖体功能，DNA复制与修复，线粒体代谢，免疫功能。而在于衰老成正相关的600个基因中，主要可以划分为：免疫，细胞骨架形成，脂肪酸和过氧化物酶体代谢，溶酶体代谢和糖胺聚糖的降解。当然，我们也可以去进行理论上的推测，由目前已知的衰老的机制通路去找寻相关的基因。从信号通路上去找，之前的研究已经从各种模式动物身上找出了IGF-1, PI3K, TOR, MAPK, AMPk, PK, NF-kB, TGF-β, NOTCH, WNT 等信号通路对长寿的影响，这些通路主要调控了能量均衡，细胞可塑性以及生物稳态的维持等，这这些信号通路中的重要调控因子，理论上都可以认为是与长寿相关的基因。例如研究最多的IGF-1通路，在正常环境中，它可以通过调控PI3K，AKT的活性来影响细胞的增殖，在不良环境中，它又可以通过调控FOXO转录因子的活性来减少应激反应的毒性积累最后，值得一提的是，衰老还是与表观遗传学调控息息相关的一个过程。宾大的Shelley L. Berger就在2016年的一篇Cell综述里面总结了衰老的七个表观遗传学表现.组蛋白的流失；.表观遗传对激活和失活的平衡被打破；转录改变；.异染色质的失衡；.细胞核核层的破裂； 全局的低甲基化和个别位置的过甲基化；. 染色质重组。而决定人表观遗传稳定性的调控因素，也可以认为是一个可遗传的长寿原因。例如组蛋白甲基化转移酶的水平高度，可以直接决定整个染色质的被摄取率，从而决定整个基因组的转录活性。总而言之，基因的调控无处不在，更不用说是长寿这样一类研究比较充分的方向，这里的回答也是片面地提了几个点。但是在我们了解这些“长寿基因”调控衰老机制的同时，也要意识到每个人的基因组都是独一无二的，有很多问题并非用笼统的医学研究就可以解决。
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